在生物科研與教學領(lǐng)域，體視顯微鏡以其立體成像、大景深和操作便捷性，成為觀察生物樣品宏觀形態(tài)與微觀細節(jié)的核心工具。無論是昆蟲解剖、植物表型分析，還是細胞培養(yǎng)監(jiān)控，規(guī)范的樣品制備流程直接決定成像質(zhì)量。本文系統(tǒng)梳理生物樣品制備的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點，結(jié)合不同樣品類型提供針對性解決方案，助力研究者突破觀測瓶頸。

一、樣品前處理：從活體取材到基礎(chǔ)固定

活體取材與即時觀察

昆蟲樣本：采用CO?麻醉法處理果蠅、蠶等模式生物，麻醉后用昆蟲針固定于軟質(zhì)蠟盤，保持肢體自然伸展。

植物組織：取新鮮葉片、花蕾或莖段，用濕棉球包裹根部維持活性，直接置于載物臺進行動態(tài)觀察（如氣孔開閉）。

水生生物：浮游生物樣本需用篩網(wǎng)過濾后，以5%甘油水溶液懸浮，防止脫水變形。

化學固定與形態(tài)保存

通用固定液：4%多聚甲醛（PFA）適用于大多數(shù)生物組織，室溫固定10-30分鐘，可保持細胞膜結(jié)構(gòu)完整性。

特殊樣本處理：含多酚類物質(zhì)（如番茄果實）需用真空滲透法固定，避免組織褐變；柔軟樣本（如腦組織）需用瓊脂糖包埋后再固定。

二、精密制片技術(shù)：針對不同樣品類型的解決方案

整體裝片法

適用場景：昆蟲觸角、植物根尖等宏觀結(jié)構(gòu)觀察。

操作要點：將樣品直接放置于載玻片，滴加PBS緩沖液保持濕潤，用0.17mm蓋玻片覆蓋，避免氣泡產(chǎn)生。

進階技巧：對透明樣本（如果蠅翅膀）可滴加1%亞甲基藍溶液，增強組織輪廓對比度。

臨時切片法

硬質(zhì)材料：木材、骨骼等需用滑動式切片機制作50-100μm厚切片，切片前用火棉膠包埋增強硬度。

柔嫩組織：采用“膠帶法”制備洋蔥表皮等單層細胞樣本，將透明膠帶粘附于組織表面后剝離，反貼于載玻片。

含液樣本：植物莖稈切片后需用吸水紙吸除乳汁，避免污染鏡頭。

活細胞動態(tài)監(jiān)測

培養(yǎng)皿直接觀測：將細胞接種于35mm玻璃底培養(yǎng)皿，體視顯微鏡下可連續(xù)觀察72小時，配合溫控裝置維持37℃環(huán)境。

微流控芯片集成：將細胞接種于帶有通道的芯片，通過液體灌注模擬體內(nèi)微環(huán)境，實現(xiàn)藥物刺激下的實時響應追蹤。

三、成像優(yōu)化策略：從照明調(diào)節(jié)到三維重構(gòu)

照明模式選擇

反射光照明：適用于昆蟲復眼、植物表皮等不透明樣品，通過環(huán)形LED光源實現(xiàn)無陰影照明。

透射光照明：觀察水蚤、輪蟲等透明生物時，采用底光式LED光源，配合中性密度濾光片降低光強。

斜射光技術(shù)：對表面紋理豐富的樣本（如昆蟲翅膀），傾斜45°入射光可突顯微觀刻痕。

三維觀察與測量

Z軸層掃：通過電動載物臺實現(xiàn)0.5μm步進層掃，結(jié)合軟件可重構(gòu)樣品三維形貌（如種子胚乳結(jié)構(gòu)）。

體尺測量：使用標定尺對昆蟲體長、植物器官尺寸進行精確測量，誤差控制在2%以內(nèi)。

四、特殊樣品處理：從超薄結(jié)構(gòu)到活體操作

超薄樣品制備

臨界點干燥：對花粉粒、孢子等微小樣本，采用CO?臨界點干燥儀處理，避免常規(guī)干燥導致的形態(tài)收縮。

噴金處理：干燥后樣品需濺射鍍膜（10nm金/鉑），消除表面電荷積累，提升成像信噪比。

活體操作技術(shù)

顯微注射：在體視鏡下將玻璃針插入斑馬魚胚胎，注射CRISPR-Cas9試劑，操作精度達1μm。

細胞移植：使用毛細管微操器轉(zhuǎn)移單個細胞，配合電動載物臺實現(xiàn)跨胚層細胞移植。

五、常見問題與解決方案

成像模糊：檢查物鏡是否沾染指紋，或樣品表面存在油脂，需用90%乙醇擦拭清潔。

色彩失真：LED光源老化導致色溫偏移，需定期用色卡校準（推薦X-Rite ColorChecker）。

樣品漂移：活體觀察時啟用載物臺加熱功能（37℃），減少溫差引起的樣本蠕動。

六、前沿技術(shù)拓展：自動化與多模態(tài)融合

隨著技術(shù)發(fā)展，體視顯微鏡正朝著智能化、多功能方向演進：

AI輔助制樣：通過機器視覺自動識別樣品類型，推薦Z佳制片流程（如固定時間、染色劑濃度）。

光片照明顯微鏡：結(jié)合體視鏡與光片照明技術(shù)，實現(xiàn)毫米級樣本的快速三維成像（如斑馬魚全腦神經(jīng)投射）。

高質(zhì)量的體視顯微鏡觀測始于嚴謹?shù)臉悠分苽?。通過優(yōu)化取材、固定、制片、成像全流程工藝，結(jié)合樣品特性選擇適配方案，研究者可充分揭示生物樣品的形態(tài)學特征。